23 Dec 2015

LA IMPORTANCIA DE HACER UN ANÁLISIS METAGENÓMICO | THE IMPORTANCE OF CONDUCTING A METAGENOMIC ANALYSIS

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LA IMPORTANCIA DE HACER UN ANÁLISIS METAGENÓMICO

En el aspecto anamnésico COMO BASE FUNDAMENTAL DEL DIAGNÓSTICO PATOGNOMÓNICO  Y  PARA GARANTIZAR UN MEJOR PLAN NUTRICIONAL PARA EL CULTIVO HIPERPRODUCTIVO, ES FUNDAMENTAL REALIZAR ANTES QUE NADA Y PRIMERO QUE TODO UN ANÁLISIS METAGENÓMICO.

A través del análisis metagenómico brindamos la posibilidad de estudiar de forma masiva el conjunto de genomas de los microorganismos presentes en el suelo, incluyendo aquellos que no son cultivables en laboratorio y que representan hasta el 99% de la población presente en el ambiente. Este tipo de estudios de última generación, al no requerir del aislamiento previo de los microorganismos, permite el estudio de todas las diversas especies presentes en la muestra, con lo cual podemos ahora caracterizar la diversidad microbiana de un ecosistema como nunca antes. Todo ello, posibilita identificar cualquier agente fitopatógeno, así como detectar desequilibrios en las poblaciones microbianas que pudieran ocasionar algún problema en el desarrollo del cultivo.

El proceso de análisis metagenómico consiste en cinco pasos claves, los cuales se describen brevemente a continuación:

              Paso 1: Extracción de material genético. Las muestras de suelo son colectadas y homogenizadas en agua libre de nucleasas. Posteriormente, se utiliza una mezcla de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico para extraer el material genético de todos los microorganismos presentes en el suelo. El material genético obtenido es eluído en solución amortiguadora Tris-HCl, y se almacena a -80 °C hasta su análisis.

              Paso 2: Amplificación génica. Se utiliza la técnica de reacción en cadena de la polimerasa para producir múltiples copias de la región hipervariable de los genes 16S y 18S, estas regiones  son marcadores que identifican a cada especie microbiana presente en la muestra.

              Paso 3: Preparación de bibliotecas genómicas. Este proceso consiste en escindir el ADN genómico en pequeños fragmentos, utilizado para ello ondas ultrasónicas. Una vez generados los fragmentos, a estos se les incorporan sus extremos, por la acción de una enzima ligasa, los adaptadores A y B (los adaptadores son fragmentos cortos de nucleótidos de secuencia conocida). Estos adaptadores proporcionan las secuencias de hibridación para la posterior amplificación y secuenciación de los fragmentos de la biblioteca.

              Paso 4: Secuenciación nucleotídica. Se utiliza a la ADN polimerasa para  incorporar nucleótidos durante la amplificación de nuevos amplicones, al mismo tiempo un láser excita a los fluoróforos, generando la emisión de fluorescencia, la cual será diferencial de acuerdo con el nucleótido incorporado. Un detector determinará el nucleótido incorporado a la cadena amplificada, y de esta manera se determina la secuencia genética de cada fragmento.

              Paso 5: Análisis de resultados. Utilizando algoritmos de biología computacional se determina el tipo de microorganismos presentes en la muestra de acuerdo a las características genéticas de las secuencias genéticas.

Esto nos dará un panorama más adecuado para evaluar los tratamientos y, sobre todo, recuperar los suelos en primera instancia, y así planear prospectivamente la nutrición más ad hoc con las condiciones de relación Suelo/Planta/Agua/Atmósfera.

Paso siguiente: realizar la Glicómica y Proteómica correspondientes al mismo tiempo que se hace el análisis de Savia, para correlacionar transitivamente los elementos catiónicos/aniónicos con los azúcares presentes y su interacción BioFisicoQuímica.

Sin estos elementos de diagnóstico y seguimiento, cualquier intento de monitoreo del estado nutrimental es incompleto, parcializado e inútil, por ser engañoso.

 

THE IMPORTANCE OF CONDUCTING A METAGENOMIC ANALYSIS

On the anamnesic aspect AS A FUNDAMENTAL BASE FOR A PATHOGNOMONIC DIAGNOSTIC AND TO GUARANTEE A BETTER NUTRITIONAL PLAN FOR THE HYPERPRODUCTIVE CROP, IT IS FUNDAMENTAL TO CONDUCT AN ANALYSIS FIRST OF ALL AND BEFORE ANYTHING ELSE.

Though metagenomic analysis we have the possibility of studying the whole genomes of microorganisms present in the soil massively, including those which are not cultivable in laboratories and that represent up to 99% of the population present in the environment. These latest generation studies, not requiring prior isolation of microorganisms, allow us to study all the different species present in the sample, a thing whereby we can characterize microbial diversity of an ecosystem as never before. All that, allows us to identify any phytopathogen agent, as well as detecting imbalances on microbial populations that may cause any problem on the development of the crop.

The process of matagenomic analysis consists of five key steps, which are briefly described below:

              Step 1: Extraction of genetic material. The samples of soil are collected and homogenized in nuclease-free water. Then, a mixture of isoamyl fenol-choloroform-alcohol is used to extract genetic material from all the microorganisms present on the soil. The obtained genetic material is eluted on Tris-HCI buffer and stored at -80 °C until it is analyzed.

              Step 2: Gene amplification. A polymerase chain reaction technique is used to produce many copies of the hyper variable region of genes 16S and 18S, these regions are markers that identify every microbial species present on the sample.

              Step 3: Preparation of genomic libraries. This process consists of cleaving genomic DNA on small fragments using ultrasonic waves. Once the fragments are generated, their ends are added, through the action of a ligase enzyme, A and B adapters (short fragments of known nucleotide sequence). This adapters provide the hybridization sequences for a later amplification and sequencing of the library fragments.

              Step 4: Nucleotide sequencing. DNA polymerase is used to incorporate nucleotides during the amplification of new amplicons, while a laser excites the fluorophors, generating the emission of fluorescence, which will be differential depending on the incorporated nucleotide. A detector will determine the nucleotide incorporated to the amplified chain, thus determining the genetic sequencing of each fragment.

              Step 5: Results analysis. The type of microorganisms present in the sample is determined by using computational biology algorithms depending on the genetic characteristics of the genetic sequences.

This gives us a more adequate environment to evaluate the treatments and, above everything else, recovering the soils on first instance, thus planning prospectively the most ad hoc nutrition under the conditions of the relationship Soil/Plant/Water/Atmosphere.

Next step: performing the corresponding Glycomics and Proteomics at the same time that a sap analysis is done in order to correlate the cationic/anionic elements with the present sugars and its BioPhysicalChemical interaction transitively.

Without these diagnostic and monitoring elements, any attempt to monitor the nutrimental state is incomplete, biased and useless, as it is misleading.

 

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