10 May 2016

Metagenómica | Metagenomics

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Metagenómica

A través del análisis metagenómico brindamos la posibilidad de estudiar de forma masiva el conjunto de genomas de los microorganismos presentes en el suelo, incluyendo aquellos que no son cultivables en laboratorio y que representan hasta el 99% de la población presente en el ambiente. Este tipo de estudios de última generación, al no requerir del aislamiento previo de los microorganismos, permite el estudio de todas las diversas especies presentes en la muestra, con lo cual podemos ahora caracterizar la diversidad microbiana de un ecosistema como nunca antes. Todo ello, posibilita identificar cualquier agente fitopatógeno, así como detectar desequilibrios en las poblaciones microbianas que pudieran ocasionar algún problema en el desarrollo del cultivo.

El proceso de análisis metagenómico consiste en cinco pasos claves, los cuales se describen brevemente a continuación:
Paso 1: Extracción de material genético. Las muestras de suelo son colectadas y homogenizadas en agua libre de nucleasas. Posteriormente, se utiliza una mezcla de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico para extraer el material genético de todos los microorganismos presentes en el suelo. El material genético obtenido es eluído en solución amortiguadora Tris-HCl, y se almacena a -80 °C hasta su análisis.
Paso 2: Amplificación génica. Se utiliza la técnica de reacción en cadena de la polimerasa para producir múltiples copias de la región hipervariable de los genes 16S y 18S, estas regiones son marcadores que identifican a cada especie microbiana presente en la muestra.
Paso 3: Preparación de bibliotecas genómicas. Este proceso consiste en escindir el ADN genómico en pequeños fragmentos, utilizado para ello ondas ultrasónicas. Una vez generados los fragmentos, a estos se les incorporan a sus extremos, por la acción de una enzima ligasa, los adaptadores A y B (los adaptadores son fragmentos cortos de nucleótidos de secuencia conocida). Estos adaptadores proporcionan las secuencias de hibridación para la posterior amplificación y secuenciación de los fragmentos de la librería.
Paso 4: Secuenciación nucleotídica. Se utiliza a la ADN polimerasa para incorporar nucleótidos durante la amplificación de nuevos amplicones, al mismo tiempo un láser excita a los fluoróforos, generando la emisión de fluorescencia, la cual será diferencial de acuerdo con el nucleótido incorporado. Un detector determinará el nucleótido incorporado a la cadena amplificada, y de esta manera se determina la secuencia genética de cada fragmento.
Paso 5: Análisis de resultados. Utilizando algoritmos de biología computacional se determina el tipo de microorganismos presentes en la muestra de acuerdo a las características genéticas de las secuencias genéticas.


 

Metagenomics

Through metagenomic analysis we provide the possibility of studying massively the set of genomes of the microorganisms in the soil, including those that cannot be cultivated in a laboratory and that represent up to 99% of the population of the environment. This kind of last generation studies, not requiring previous isolation from microorganisms, allow the study of all the species in the sample, this way we can characterize the microbial diversity of an ecosystem as never done before. All of this, allows us to identify any phytopathogen agent, as well as detecting unbalance on the microbial population which may cause any problem on the crop’s development.

The process of metagenomic analysis consists of five key steps, which are briefly described below:
Step 1: Genetic material extraction. The samples on the soil are collected and homogenized in nuclease-free water. Then, a combination of isoamyl phenol-chloroform-alcohol is used to extract genetic material from all the microorganisms present in the soil. The genetic material is then eluted in a buffer solution, Tris-HCI, and then it is stored at -80 °C until it is analyzed.
Step 2: Genic amplification. A chain reaction technique is used from the polymerase to produce many copies of the hypervariable region of genes 16S and 18S, these regions are markers that identify each microbial species present on the sample.
Step 3: Genomic library preparation. This process consists in cleaving genomic DNA into small fragments, using ultrasonic waves for this. Once the fragments are generated the adapters A and B (adaptors are short fragments of nucleotides of a known sequence) they are incorporated to its extremes, because of the ligase enzyme. These adaptors provide the hybridization sequences for a later amplification and sequencing of the library fragments.
Step 4: Nucleotidic sequentiation. DNA polymerase is used to incorporate nucleotides during the amplification of new amplicons, at the same time a laser excites the fluorophores, generating a fluorescence emission, which will be differential depending on the incorporated nucleotide. A detector will determine the incorporated nucleotide to the amplified chain, this way we can determine the genetic sequence of each fragment.
Step 5: Results analysis. Using computational biology algorithms, the kind of microorganisms present on the sample are determined according to the genetic traits of the the genetic sequences.

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